转录调控的研究历史比较长，相关研究在近十年来仍一直增长，也是近年来高分文章的焦点之一，在2023年最佳国自然“中标”研究热点，转录调控中标率高达189。作为国自然热点之一的肿瘤微环境的研究在近几年也一直处于上升趋势，转录调控在肿瘤发生、发展中扮演着重要角色，将转录调控与肿瘤微环境进行结合，已成为肿瘤研究的热点领域之一。转录因子作为转录调控的关键因子，能够影响基因的转录和表达，从而影响细胞的生理功能和肿瘤的发生和发展，转录调控失调是肿瘤发生发展的重要标志之一，发现靶向癌症治疗涉及的转录调控关键蛋白是抗肿瘤药物的研发的热门策略之一。
2023年11月，美国国家癌症研究中心的研究团队在Cell Reports期刊(IF=8.8)上发表了题为“Genome-wide profiling of transcription factor activity in primary liver cancer using single-cell ATAC sequencing”的文章。研究人员通过对16例原发性肝细胞癌（PLC）患者，包括13例HCC和3例iCCA，进行单细胞ATAC-seq，发现了31个转录因子的基序富集水平可以区分肝细胞癌（HCC）和肝内胆管细胞癌（iCCA），核受体、ETS和POU 等TF基序家族揭示了HCC和iCCA肿瘤之间的转录调控，这可能有助于对PLC亚型的特异性治疗。
研究背景
肝细胞癌（HCC）和胆管癌（CCA）是原发性肝癌（PLC）的两种主要形式，肝细胞被认为是大多数HCC的来源，胆管细胞被认为是iCCAs的来源，但最近有许多研究表明，肝细胞向胆道样细胞转分化形成iCCA，肝祖细胞是这两种肿瘤细胞的来源。TFs是谱系决定的重要调节因子，癌细胞对特定转录因子功能的丧失高度敏感，说明转录因子控制特定细胞命运的复杂性。在PLC中，有哪些转录因子基序富集，以及这些转录因子如何影响肿瘤生物学，目前仍不清楚。
研究结果
1、scATAC-seq揭示PLC的细胞组成多样性
为了探究PLC中染色质可及性和转录调控，作者对16例患者样本，包括13例HCC和3例iCCA，进行了scATAC-seq检测（图1A）。18,631个细胞的UMAP可视化图显示，一共有33个聚类，其中一些是由单个患者主导的，而另一些则是由来自多个患者的细胞组成（图1B）。为了根据细胞类型对每个聚类进行分类，作者使用了他们之前发表的对同一批患者进行scRNA-seq的数据，将匹配的scRNA-seq注释数据作为参考数据集，利用Signac R包将细胞类型标签转移到scATAC-seq数据上，鉴定了恶性细胞、T细胞、和单核细胞等6种细胞类型（图1C），比较不同患者的细胞类型组成分布，发现每个患者中大多数为T细胞，恶性细胞的丰度在不同患者中有显著的差异（图1D）。
图1.16例原发性肝癌患者的18,631个细胞的单细胞染色质可及性
2、scATAC-seq中的微环境分析
之前已有研究证明肿瘤微环境和恶性细胞之间的相互作用对肿瘤的表型起着重要作用，为了进一步表征微环境成分细胞，作者通过使用之前scRNA-seq的数据对细胞类型进行注释，来识别微环境每个组成部分的细胞亚型。在几个HCC患者中检测到单核细胞亚型，包括S100A8+、CXCL10+ M1和CCL4L2+ M2群体（图2A、B），随后作者又观察到T细胞和B细胞亚型组成在患者间存在高异质性，在HCC或iCCA肿瘤类型中没有任何确定的亚型的显著富集，B细胞分为初始B细胞和血浆细胞两个群体（图2C），大部分肿瘤患者细胞中都包含了这两种B细胞类型（图2D）。在T细胞中，同时检测到CD4+和CD8+群体，大部分CD4+群体为IL-7R+中央记忆T细胞，CD8+ T细胞群主要是GZMK+效应记忆T细胞（图2E，F）。这些结果表明，开放染色质谱捕获了PLC微环境的全部多样性，在HCC和iCCA肿瘤之间存在广泛重叠。
图2.scATAC-seq中的微环境分析
3、独特的TF基序富集谱可以区分HCC和iCCA恶性细胞
作者研究了HCC和iCCA两种肿瘤之间致癌转录程序调控的差异。首先，作者发现恶性细胞在患者之间存在明显的分化，而HCC和iCCA来源的细胞之间没有明显的分化（图3A），值得注意的是，在所有恶性细胞中使用TF基序富集进行聚类时，作者观察到HCC和iCCA来源的细胞之间存在分化（图3B），这表明TF结合位点的富集在驱动HCC和iCCA恶性细胞之间的变化中影响最大。接下来为了确定在HCC和iCCA恶性细胞之间可及区的最重要转录因子结合位点，作者比较了HCC和iCCA恶性细胞之间的转录因子结合位点富集情况，发现了31个显著差异富集的转录因子基序，其中在iCCA患者中，主要为POU和ETS因子富集，而在HCC患者中以核受体（NRs）为主（图3C）。
为了确定这些结果是否适用于本批患者之外的样本，作者使用这31个转录因子基序的特征表达对先前发表的关于153例 PLC患者的转录组数据进行层次聚类，将患者分成两个群体，分别由HCC和iCCA主导（图3D）。 将这31个转录因子结合位点作为HCC或iCCA肿瘤亚型的分选器，进行ROC曲线分析时，观察到AUC为0.947 （图3E）。这表明转录因子结合位点的特征能够区分HCC和iCCA肿瘤。
图3.HCC和iCCA肿瘤之间TF基序富集差异
4、NR、ETS、POU因子在原发性肝癌中的表达
接下来，作者研究了在相同的TIGER-LC队列（HCC = 62，iCCA = 91）中TF基序标签的表达变化。对bulk RNA-seq样本，使用ssGSEA生成TF富集分数，POU组在iCCA中的表达显著高于HCC，而在iCCA肿瘤中，POU组的表达高度可变（图4A，B），ETS组和NR组在iCCA和HCC肿瘤中表达均匀（图4B），相关性图结果显示，POU组与NR组之间的表达没有相关性，但NR组和ETS组的表达在HCC和iCCA肿瘤群体中呈显著负相关（图4C，D）。此外，对转录因子的motif 标签进行IPA分析，揭示了通过ERK1/2中间体将NR因子与ETS因子连接起来的网络。这些结果表明NR和ETS因子能够显著区分HCC和iCCA肿瘤，并且可能相互作用形成PLC亚型。
图4. NR、ETS、POU因子在原发性肝癌中的表达
5、PLC恶性细胞中TF基序富集的异质性
由于PLC是一种遗传异质性疾病，作者决定检测这种患者间的异质性是否也存在于TF基序富集之中。首先，作者鉴定了每个患者中最显著富集的TF motif，并在整个队列中进行比较，结果显示患者细胞内TF基序富集的存在高水平异质性（图5A）。为了识别动态富集的TF，作者对每个有足够数量恶性细胞的患者进行了轨迹分析，并识别出显示富集梯度变化和拟时序变化的TF基序，2例患者（C56和H65）在所有恶性细胞中TF基序的富集没有动态变化，而其他6例患者有几个TF基序沿着拟合的树轴富集发生梯度变化（图5B，C）。这些分析表明，在转录调控水平上，PLC也表现出显著的患者间和患者内异质性。
图5.PLC恶性细胞中TF基序富集的异质性
6、NR基序和POU基序与预后特征相关
为了进一步了解在PLC中确定的肿瘤类型特异性TF基序家族的功能，作者接下来评估了其与临床特征的关联性。在先前确定的几个HCC分子分类中，NR组的富集显著降低（图6A），临床特征包括高AFP水平和低分化肿瘤也与较低的NR组富集显著相关（图6B），与此结果一致，在TIGER-LC和TCGA-LIHC队列中，NR组富集程度较低的患者的总生存率较差（图6C），iCCA肿瘤中没有发现这些与NR组的关联。POU群的富集在具有TP53突变的肿瘤中和TIGER分类中的趋势升高（图6D），POU组富集程度较高的患者的总生存率较差（图6E）。
图6.NR和POU转录因子与预后因素相关
研究结论
在本研究中，作者通过对PLC样本进行scATAC-seq，证明了不同的转录因子基因家族可以区分HCC和iCCA，发现了PLC系谱特异性的转录模式，又进一步证明转录因子基因家族的差异富集与PLC患者的生存相关，对有关转录因子在维持肝细胞或胆管上皮细胞特征中的作用提供有价值的见解，这些特征对患者的预后具有重要影响。
原文链接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01458-4
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